Repertório de serina proteases como componentes do degradoma de Leishmania spp / Serine protease repertoire as components of Leishmania spp degradation

Esta tese faz uma abordagem in silico e experimental sobre as serina proteases de Leishmania spp. Na primeira etapa do estudo são descritas as serina proteases como parte do degradoma destes parasitos. Os genes de serina protease (n = 26 a 28) em Leishmania spp que codificam proteínas com uma ampla faixa de massa molecular, são descritos juntamente com seus graus de sintenia cromossômica e alélica. Em meio a 17 serina proteases putativas de Leishmania spp apenas 18 % possuem duas funções descritas experimentalmente como propriedades para remover o peptídeo sinal de pro-proteínas secretoras (clã SF), como maturases de outras proteínas (clã SB) e com atividades similares as metacaspase (clã SC). Análises in silico indicaram que o conjunto de serina proteases de Leishmania spp pode estabelecer interrelações funcionais com outras proteínas de Leishmania spp significando atuações essenciais na fisiologia do parasito. Padrões de redes distintos podem ocorrer e a complexidade destas redes difere entre as espécies relacionadas ao subgênero Viannia e Leishmania: Leishmania (V.) braziliensis (n = 215); Leishmania (L.) mexicana (n = 130); L. (L.) donovani (n=56) Leishmania (L.) major (n = 45); Leishmania (L.) infantum (n = 23). O fato das serina proteases de L. (V.) braziliensis indicarem mais possibilidades de interações com outras proteínas do parasito foi a motivação para segunda etapa deste estudo

Esta etapa consistiu em uma abordagem experimental e in silico investigando as serina proteases deste parasito, incluindo atividade enzimática de serina proteases de frações subcelulares obtidas por cromatografia de afinidade com benzamidina, reações em cadeia da polimerase com transcrição reversa e ensaios in silico de localização subcelular de subtilisinas. Promastigotas apresentaram serina proteases com atividade gelatinolítica na fração citosólica (43 kDa a 170 kDa) e na fração membrana (67 kDa a 170 kDa). Ambas as frações também demostraram propriedades de catálise sobre os substratos peptídicos N-benziloxicarbonil-L-fenilalanil-L-arginina 7-amino-4-metilcumarina (fração citosólica = 392 ± 30 mol.min-1 mg of protein-1; fração de membrana = 53 ± 5 mol.min-1 mg of protein-1) e N-succinil-L-alanina-L-fenilalanina-L-lisina 7-amino-4-metilcumarina (fração citosólica = 252 ± 20 mol.min-1 mg of protein-1; fração de membrana = 63.6 ± 6.5 mol.min-1 mg of protein-1) com diferentes perfis de especificidade demonstrada pela inibição com aprotinina (19 % a 80 %) e fluoreto de fenilmetilsulfonil (3 % a 69 %), dependendo da fração subcelular e do substrato. A expressão dos genes das subtilisinas (LbrM.13.0860 e LbrM28.270) e da triparedoxina peroxidase (LbrM.15.1080) também foram observadas, com a detecção dos transcritos de 200 pb, 162 pb e 166 pb, respectivamente. Ensaios subsequentes indicaram que a enzima codificada pelo gene LbrM.13.0860 tem localização no citosol e a codificada pelo gene LbrM.28.2570 na membrana do parasito. Coletivamente, os dados aqui obtidos indicam relevantes contribuições das serina proteases na fisiologia da Leishmania spp, incluindo as subtilisinas das promastigotas de L. (V.) braziliensis. (AU)

Understanding serine proteases implications on Leishmania spp lifecycle.

Serine proteases have significant functions over a broad range of relevant biological processes to the Leishmania spp lifecycle. Data gathered here present an update on the Leishmania spp serine proteases and the status of these enzymes as part of the parasite degradome. The serine protease genes (n = 26 to 28) in Leishmania spp, which encode proteins with a wide range of molecular masses (35 kDa-115 kDa), are described along with their degrees of chromosomal and allelic synteny. Amid 17 putative Leishmania spp serine proteases, only ∼18% were experimentally demonstrated, as: signal peptidases that remove the signal peptide from secretory pre-proteins, maturases of other proteins and with metacaspase-like activity. These enzymes include those of clans SB, SC and SF. Classical inhibitors of serine proteases are used as tools for the characterization and investigation of Leishmania spp. Endogenous serine protease inhibitors, which are ecotin-like, can act modulating host actions. However, crude or synthetic based-natural serine protease inhibitors, such as potato tuber extract, Stichodactyla helianthus protease inhibitor I, fukugetin and epoxy-α-lapachone act on parasitic serine proteases and are promising leishmanicidal agents. The functional interrelationship between serine proteases and other Leishmania spp proteins demonstrate essential functions of these enzymes in parasite physiology and therefore their value as targets for leishmaniasis treatment.

Diferenças na expressão gênica e na forma de direcionamento da região COOH-terminal de císteina-proteinase B de Leishmania (Leishmania) amazonensis / Differences in gene expression and direction of the COOH-Terminal region of cysteine proteinase B of Leishmania (Leishmania) amazonensis

A Leishmania (Leishmania) amazonensis apresenta mecanismos de adaptação guiados porsuas proteinases. Neste contexto, destacam-se as cisteína proteinases (CPs) onde acisteína proteinase B (CPB) é a CP mais estudada dentre as CPs deste parasito. O focodeste trabalho é a região COOH-terminal da CPB (cyspep), gerada a partir doprocessamento final desta proteinase. O estudo foi conduzido em cinco fases: obtenção dacyspep recombinante (rcyspep); avaliação da antigenicidade da rcyspep em camundongosexperimentalmente infectados com L.(L.) amazonensis; diferenciação in vitro dospromastigotas em amastigotas; avaliação da expressão do gene cpb ao longo dadiferenciação do parasito; e detecção da cyspep nas formas promastigotas e amastigotas doparasito. O polipeptídeo rcyspep, de 14 kDa, foi obtida em sistema pET28-a e purificadopara posterior produção de anticorpos policlonais específicos em camundongos. Observouseque, durante a infecção em camundongos, há uma resposta imune humoral contra orcyspep, caracterizada por um aumento da detecção de anti-cyspep quando comparado comanimais de controle (p <0,05). Nos ensaios de diferenciação constatamos três padrõesmorfológicos ao logo de 96 horas de análise, em uma cinética temporal: formas alongadascom flagelo livre, arredondados com flagelo e arredondadas sem flagelo por microscopia.Adicionalmente a cultura foi analisada por citometria de fluxo demonstrando uma migraçãogradual da população da região R1 para região R2 do dotplot indicando uma diminuição notamanho e aumento da granulosidade celular. Observamos que ao longo destadiferenciação ocorre um aumento da quantidade de transcritos do gene cpb, nos tempos de48 horas (1,3 ×), 72 horas (3,2 ×) e 96 horas (3,4 ×) nas preparações de cDNA dosparasitos, quando comparada com os resultados de quantificação realizados compreparações de cDNA dos promastigotas...

Leishmania (Leishmania) amazonensis presents adaptive mechanisms guided by theirproteinases. In this context, we highlight the cysteine proteinases (CPs) where the cysteineproteinase B (CPB) is the most studied CP among these parasites. The focus of this work isthe COOH-terminal region of CPB (cyspep), generated during the final processing stage ofthis proteinase. Our study comprises five main phases: obtaining of a recombinant cyspeppolypeptide (rcyspep); evaluation of the antigenicity of rcyspep in mice experimentallyinfected with L. (L.) amazonensis; in vitro differentiation of promastigotes into amastigotes;evaluation of cpb gene expression throughout morphological differentiation of the parasite;and detection of cyspep in promastigotes and amastigotes of L. (L.) amazonensis. Thercyspep polypeptide, with 14 kDa, was obtained using a pET28-a system and, subsequently,specific polyclonal antibodies were produced by inoculation in mice. We observed that,during mice infection, there is a humoral immune response against rcyspep, characterized byan increase in detection of anti-cyspep when compared to control animals (p<0.05). Duringdifferentiation assays three morphological patterns could be observed over 96 hours ofobservation: elongated shapes with free flagellum, rounded shapes with free flagellum androunded shapes without visible flagellum. The data point to a gradual migration of thepopulation of parasites from region R1 to region R2 into the dotplot indicating a decrease insize and increase in cell granularity. We observed that alongside the morphologicaldifferentiation there is an increase in the amount of cpb gene transcripts, in time of 48 hours(1.3 ×), 72 hours (3.2 ×) and 96 hours (× 3.4), compared with quantitation results obtainedwith cDNA of promastigotes...